1、樣本準(zhǔn)備過程中防止蛋白質(zhì)降解和保留翻譯后修飾

     樣本準(zhǔn)備過程中，細(xì)胞會釋放蛋白酶和/或去磷酸化酶，為了減少這些酶的活性，處理樣本的過程應(yīng)在冰上進(jìn)行，并預(yù)先冷卻所有緩沖液，并且建議用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液。

2、磷酸化特異性抗體的選擇

     選擇磷酸化特異性抗體時(shí)，選擇所要檢測位點(diǎn)的磷酸化抗體至關(guān)重要。磷酸化都會使蛋白質(zhì)的分子量增加80Da，檢查抗體是否檢測到磷酸化靶蛋白的分子量正確的條帶也很重要。

3、誘導(dǎo)磷酸化

     課題設(shè)計(jì)可能需要在收獲前刺激細(xì)胞，以確保蛋白質(zhì)被磷酸化。 例如，在特定細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑激活后，靶蛋白可能在目的位點(diǎn)被磷酸化。

4、濃縮樣品

     當(dāng)觀察相對罕見的磷酸化事件時(shí)，可以使用最小體積的裂解緩沖液來裂解樣品達(dá)到濃縮的目的。 如果目的蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞位置已知，例如，如果您的蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核中，您可以先進(jìn)行細(xì)胞分級分離，僅將細(xì)胞核裂解組份進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。 您也可以考慮使用針對您感興趣的蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行免疫沉淀（IP），而不管磷酸化狀態(tài)如何。

5、優(yōu)化封閉液

     為您的抗體選擇最佳的封閉試劑。 對于磷酸化分析，可以從含酪蛋白或BSA的TBS緩沖液開始。 使用牛奶會導(dǎo)致更高的背景，因?yàn)樗械牡鞍踪|(zhì)可能會干擾磷酸化蛋白質(zhì)的目標(biāo)檢測。 其他封閉試劑如雞卵清蛋白，魚明膠和市售合成封閉試劑也可提供可行的替代方案。 在計(jì)劃磷酸化蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)，重要的是要記住，沒有一種適合所有樣品的封閉液。

6、轉(zhuǎn)印膜的選擇

     可以將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上。 PVDF膜具有高機(jī)械強(qiáng)度，需要膜剝離和再雜交時(shí)使用，通常情況下，當(dāng)您使用總蛋白作為磷酸化靶標(biāo)的上樣對照時(shí)。 由于PVDF具有比硝酸纖維素更高的結(jié)合能力，因此優(yōu)選用于低豐度的磷酸化靶標(biāo)。 然而，PVDF的結(jié)合能力增強(qiáng)也意味著與硝酸纖維素相比，您有可能看到更高水平的非特異性結(jié)合和背景。 如果您正在進(jìn)行全蛋白內(nèi)參歸一化或使用熒光二抗，建議使用低熒光背景PVDF（LF PVDF）膜。

7、洗滌

     用于執(zhí)行洗滌步驟的緩沖液的類型也可以對信號與背景產(chǎn)生影響。 通常，與基于磷酸鹽緩沖液（PBS）相比，使用基于tris緩沖液（TBS）通?？梢援a(chǎn)生更強(qiáng)的信號。 注意，PBS中磷酸根離子的存在可能干擾來自磷酸化靶蛋白的信號。 在洗滌緩沖液中加入Tween-20等洗滌劑也有助于去除非特異性結(jié)合在膜上的物質(zhì)。

8、總蛋白質(zhì)的檢測

     使用檢測目標(biāo)蛋白總水平的抗體，可以確定相對于總目標(biāo)蛋白的磷酸化比例。這使您可以比較不同處理的影響，并提供內(nèi)參。

9、總蛋白內(nèi)參歸一化

     總蛋白內(nèi)參歸一化是一種用于量化目標(biāo)蛋白質(zhì)豐度的技術(shù)。這涉及將條帶灰度值按照樣品中總蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

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